Anforderungen für das Einfrieren und Auftauen von Zellen

Etablierte Zelllinien sind eine wertvolle Ressource für Forschungslabors. Doch selbst die bestgepflegten Zelllinien in einer kontinuierlichen Kultur sind anfällig für genetischen Drift, Seneszenz und mikrobielle Kontamination. Daher müssen die Zellen eingefroren und für die Langzeitlagerung konserviert werden.

Im Folgenden finden Sie einige Richtlinien, die für das Einfrieren von Zellen wichtig sind. Wie bei allen Zellkulturverfahren ist es am besten, die Anweisungen zu befolgen, die mit Ihrer Zelllinie geliefert werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

  • Stellen Sie sicher, dass die Zellen vor dem Einfrieren zu mindestens 90% lebensfähig sind und eine hohe Konzentration aufweisen. Achten Sie darauf, dass Sie die Anweisungen für das optimale Einfrieren je nach verwendeter Zelllinie befolgen.
  • Verwenden Sie einen Kryo-Gefrierschrank mit kontrollierter Geschwindigkeit, um die Zellen langsam einzufrieren, indem Sie die Temperatur um 1 Grad pro Minute senken.
  • Verwenden Sie immer das empfohlene Einfriermedium wie DMSO oder Glycerin. Wenn Sie primäre Zellen oder Zelllinien zum ersten Mal einfrieren, wird die Verwendung eines zellspezifischen, optimierten Gefriermediums wie die BioLife CryoStor® Gefriermedienfamilie empfohlen.
  • Alle Lösungen und Geräte, die mit den Zellen in Berührung kommen, sollten steril sein, einschließlich der Kryogefäße, in denen die gefrorenen Zellen gelagert werden.

Das Auftauen von gefrorenen Zellen kann ein kompliziertes Verfahren sein, bei dem es sowohl auf Schnelligkeit als auch auf Präzision ankommt, um zu gewährleisten, dass die meisten der Zellen überleben. Um das bestmögliche Ergebnis zu erzielen, sollten Sie sich genau an die Anweisungen halten, die Sie mit Ihren Zellen und anderen Komponenten erhalten haben. Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie die folgenden Hinweise beachten:

  • Schnelles Auftauen der Zellen in einem 37° C warmen Wasserbad, bis alles sichtbare Eis geschmolzen ist
  • Bevor Sie die Zellen bebrüten, verdünnen Sie sie mit einem vorgewärmten Wachstumsmedium
  • Um die Rückgewinnung zu verbessern, die aufgetauten Zellen mit hoher Dichte plattieren
  • Arbeiten Sie in einer Laminar-Flow-Haube und verwenden Sie stets die richtige aseptische Technik
  • Tragen Sie eine persönliche Schutzausrüstung wie eine Gesichtsmaske oder eine Schutzbrille (Kryoflaschen, die in einer flüssigen Phase aufbewahrt werden, könnten beim Auftauen explodieren)
  • Einige Gefriermedien enthalten DMSO, das den Eintritt organischer Moleküle in das Gewebe fördert. Achten Sie darauf, dass Sie für den Umgang mit Chemikalien, die DMSO enthalten, geeignete Geräte verwenden.
  • BioLife Cell Thawing Media eignet sich für größere Mengen von Plazenta-/Nabelschnurblut, das in Beuteln mit DMSO kryokonserviert wird.

Erforderliche Materialien für das Auftauen von Zellen

Schritt-für-Schritt-Verfahren zum Auftauen gefrorener Zellen

  1. Entnehmen Sie zunächst das Kryogefäß mit den gefrorenen Zellen aus dem Flüssigstickstofflager oder dem Tiefkühlschrank.
  2. Stellen Sie die Küvette in ein Wasserbad bei 37° C und schwenken Sie sie vorsichtig, bis nur noch eine kleine Menge Eis übrig ist. Alternativ können Sie ein automatisiertes Zellauftaugerät wie den BioLife ThawSTAR® CFT1.5 oder CFT2 verwenden, indem Sie die gefrorene kryogene Küvette in das Gerät einlegen. Entnehmen Sie es, wenn das Gefäß am Ende des Auftauzyklus angehoben wird, und fahren Sie fort.
  3. Denken Sie daran, dass es wichtig ist, die Exposition gegenüber der Raumtemperatur zu verringern, wenn Sie gefrorene Zellen aus dem Lager nehmen. Wenn die Zellen nicht sofort verwendet werden sollen, legen Sie sie auf Trockeneis oder in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff. Zellen in 1,8-mL- und 2,0-mL-Kryovials können auf Trockeneis gefroren aus dem Tiefkühllager in die Auftauvorrichtung im BioLife ThawSTAR® CFT Transporter transportiert werden. Alternativ können Kryovials mit Zellen gefroren bei <-150℃ im BioT™ LN2 Transporter transportiert werden, der flüssigen Stickstoff sicher in einem Absorptions-/Baffelkissen enthält.
  4. Bringen Sie das Fläschchen in eine Laminar-Flow-Haube.
  5. Wischen Sie die Außenseite des Fläschchens mit 70%igem Ethanol oder Isopropanol ab.
  6. Übertragen Sie die bevorzugte Menge an vorgewärmtem kompletten Wachstumsmedium, das für Ihre Zelllinie geeignet ist, in die aufgetauten Zellen. Aufgetaute Zellen, die in Kryovials eingefroren sind, werden im Allgemeinen aus dem kleinen Kryovial in ein Zentrifugenröhrchen mit vorgewärmtem Wachstumsmedium pipettiert.
  7. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 x g für etwa 5-10 Minuten bei Raumtemperatur. Die Geschwindigkeit und Dauer der Zentrifugation hängt von den Zelltypen ab.
  8. Prüfen Sie nach Abschluss der Zentrifugation die Klarheit des Überstandes sowie die Sichtbarkeit eines vollständigen Pellets.
  9. Ohne das Pellet zu stören, schütten Sie den Überstand nach und nach aus.
  10. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und lassen Sie eine kleine Menge des Mediums zurück, um sicherzustellen, dass das Zellpellet nicht zerrissen wird.
  11. Klopfen Sie vorsichtig auf das Rohr, um das Zellpellet zu resuspendieren.
  12. Bringen Sie sie in die entsprechenden Zellkulturgefäße und in die vorgeschlagene Zellkulturumgebung.
  13. Jetzt sind die Zellen bereit für den Einsatz in nachgeschalteten Anwendungen.