Requisiti delle celle di congelamento e scongelamento

Le linee cellulari consolidate sono una risorsa preziosa per i laboratori di ricerca. Tuttavia, anche le linee cellulari meglio conservate in una coltura continua possono essere soggette a deriva genetica, senescenza e contaminazione microbica. Pertanto, le cellule devono essere congelate e conservate per lo stoccaggio a lungo termine.

Di seguito sono riportate alcune linee guida essenziali per il congelamento delle cellule. Come per tutte le procedure di coltura cellulare, è meglio seguire le istruzioni fornite con la linea cellulare per ottenere risultati ottimali.

  • Assicurarsi che le cellule siano vitali almeno al 90% e ad alta concentrazione prima del congelamento. Assicurarsi di seguire le istruzioni di congelamento ottimali in base alla linea cellulare utilizzata.
  • Utilizzando un crio-congelatore a velocità controllata, le cellule vengono congelate lentamente riducendo la temperatura di 1 grado al minuto.
  • Utilizzare sempre il mezzo di congelamento consigliato, come DMSO o glicerolo. Se si congelano cellule primarie o linee cellulari per la prima volta, si raccomanda l'uso di un terreno di congelamento ottimizzato e specifico per le cellule, come la famiglia di terreni di congelamento BioLife CryoStor®.
  • Tutte le soluzioni e le apparecchiature che entrano in contatto con le cellule devono essere sterili, comprese le crioviali utilizzate per la conservazione delle cellule congelate.

Lo scongelamento delle cellule congelate può essere una procedura complicata in cui è essenziale essere rapidi e precisi per garantire la sopravvivenza della maggior parte delle cellule. Per ottenere il miglior risultato possibile, si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite con le cellule e gli altri componenti. Per ottenere risultati ottimali, seguire le seguenti linee guida:

  • Scongelare rapidamente le celle in un bagno d'acqua a 37° C fino a sciogliere tutto il ghiaccio visibile
  • Prima di incubare le cellule, diluirle con un terreno di coltura preriscaldato.
  • Per migliorare il recupero, piastrare le celle scongelate ad alta densità.
  • Lavorare in una cappa a flusso laminare e utilizzare sempre una tecnica asettica corretta.
  • Indossare dispositivi di protezione personale come maschera o occhiali (le crioviali mantenute in fase liquida potrebbero esplodere quando vengono scongelate).
  • Alcuni mezzi di congelamento contengono DMSO, che favorisce il processo di ingresso delle molecole organiche nei tessuti. Assicurarsi di utilizzare attrezzature per la manipolazione dei prodotti chimici contenenti DMSO.
  • BioLife Cell Thawing Media è efficace per volumi maggiori di sangue placentare/di cordone ombelicale crioconservato in sacche di DMSO.

Materiali necessari per lo scongelamento delle celle

Processo passo-passo per lo scongelamento delle cellule congelate

  1. Iniziare a rimuovere la crioviale che contiene le cellule congelate dallo stoccaggio in azoto liquido o dal congelatore ultrafreddo.
  2. Mettere la fiala di cellule in un bagno d'acqua a 37° C e agitare delicatamente, finché non rimane solo una piccola quantità di ghiaccio. In alternativa, utilizzare uno strumento automatico per lo scongelamento delle cellule, come BioLife ThawSTAR® CFT1.5 o CFT2, inserendo la fiala criogenica congelata nel dispositivo. Recuperarla quando la fiala viene sollevata alla fine del ciclo di scongelamento e procedere.
  3. È importante ridurre l'esposizione alla temperatura ambiente quando si rimuovono le cellule congelate dallo stoccaggio. Se le cellule non devono essere utilizzate immediatamente, metterle su ghiaccio secco o in un contenitore di azoto liquido. Le cellule in crioviali da 1,8 mL e 2,0 mL possono essere trasportate dalla conservazione congelata al dispositivo di scongelamento all'interno del BioLife ThawSTAR® CFT Transporter mentre sono congelate su ghiaccio secco. In alternativa, le crioviali contenenti cellule possono essere trasferite congelate a <-150℃ all'interno del BioT™ LN2 Transporter, che contiene azoto liquido in modo sicuro all'interno di un assorbente/tappetino.
  4. Spostare la fiala in una cappa a flusso laminare.
  5. Pulire l'esterno della fiala con etanolo o isopropanolo al 70%.
  6. Trasferire nelle cellule scongelate la quantità preferita di terreno di coltura completo preriscaldato adatto alla propria linea cellulare. Le cellule scongelate e congelate in crioviale vengono generalmente pipettate dalla piccola crioviale in una provetta da centrifuga contenente un terreno di crescita preriscaldato.
  7. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per circa 5-10 minuti a temperatura ambiente. La velocità e la durata della centrifugazione cambiano a seconda dei tipi di cellule.
  8. Una volta completata la centrifugazione, verificare la limpidezza del surnatante e la visibilità di un pellet completo.
  9. Senza disturbare il pellet, versare gradualmente il surnatante.
  10. Rimuovere il surnatante con una pipetta e lasciare una piccola quantità di terreno per garantire che il pellet di cellule non venga interrotto.
  11. Picchiettare con cura la provetta per risospendere il pellet di cellule.
  12. I contenitori per la coltura cellulare sono stati spostati nel recipiente appropriato, così come l'ambiente di coltura cellulare suggerito.
  13. Ora le celle sono pronte per essere utilizzate nelle applicazioni a valle.