Exigences relatives aux cellules de congélation et de décongélation

Les lignées cellulaires établies sont une ressource précieuse pour les laboratoires de recherche. Cependant, même les lignées cellulaires les mieux conservées dans une culture continue peuvent être sujettes à la dérive génétique, à la sénescence et à la contamination microbienne. Les cellules doivent donc être congelées et préservées pour un stockage à long terme.

Les lignes directrices suivantes sont essentielles pour la congélation des cellules. Comme pour toutes les procédures de culture cellulaire, il est préférable de suivre les instructions fournies avec votre lignée cellulaire pour obtenir des résultats optimaux.

  • Assurez-vous que les cellules sont viables à au moins 90 % et à une concentration élevée avant de les congeler. Veillez à suivre les instructions de congélation optimales en fonction de la lignée cellulaire utilisée.
  • L'utilisation d'un cryocongélateur à débit contrôlé permet de congeler lentement les cellules en réduisant la température d'un degré par minute.
  • Utilisez toujours le milieu de congélation recommandé, tel que le DMSO ou le glycérol. Si vous congelez des cellules primaires ou des lignées cellulaires pour la première fois, il est recommandé d'utiliser un milieu de congélation optimisé et spécifique à la cellule, comme les milieux de congélation de la famille BioLife CryoStor®.
  • Toutes les solutions et tous les équipements qui entrent en contact avec les cellules doivent être stériles, y compris les cryovials utilisés pour stocker les cellules congelées.

La décongélation des cellules congelées peut être une procédure complexe au cours de laquelle il est essentiel d'être à la fois rapide et précis afin de garantir la survie de la plupart des cellules. Pour obtenir les meilleurs résultats possibles, il est recommandé de respecter scrupuleusement les instructions fournies avec les cellules et les autres composants. Pour obtenir les meilleurs résultats, suivez ces instructions :

  • Décongeler rapidement les cellules dans un bain d'eau à 37° C jusqu'à ce que toute la glace visible ait fondu.
  • Avant d'incuber les cellules, diluez-les dans un milieu de croissance préchauffé.
  • Pour améliorer la récupération, plaquer les cellules qui ont été décongelées à haute densité.
  • Travaillez dans une hotte à flux laminaire et utilisez toujours la technique aseptique correcte.
  • Porter un équipement de protection individuelle tel qu'un masque ou des lunettes de protection (les cryovials conservés en phase liquide peuvent potentiellement exploser lorsqu'ils sont décongelés).
  • Certains milieux de congélation contiennent du DMSO qui facilite l'entrée des molécules organiques dans les tissus. Veillez à utiliser l'équipement nécessaire pour manipuler les produits chimiques contenant du DMSO.
  • Le milieu de décongélation cellulaire BioLife est efficace pour les grands volumes de sang placentaire/de cordon ombilical cryoconservés dans des poches de DMSO.

Matériaux nécessaires à la décongélation des cellules

Processus de décongélation des cellules congelées, étape par étape

  1. Commencez par retirer le cryovial qui contient les cellules congelées du stockage dans l'azote liquide ou du congélateur ultra-froid.
  2. Placer le flacon de cellules dans un bain-marie à 37° C et agiter doucement jusqu'à ce qu'il ne reste plus qu'une petite quantité de glace. Il est également possible d'utiliser un instrument de décongélation cellulaire automatisé tel que le BioLife ThawSTAR® CFT1.5 ou CFT2 en insérant le flacon cryogénique congelé dans l'appareil. Récupérez-le lorsque le flacon est soulevé à la fin du cycle de décongélation et continuez.
  3. N'oubliez pas qu'il est important de réduire l'exposition à la température ambiante lorsque vous retirez les cellules congelées du stockage. Si les cellules ne sont pas utilisées immédiatement, placez-les sur de la glace sèche ou dans un conteneur d'azote liquide. Les cellules dans des cryovials de 1,8 ml et 2,0 ml peuvent être transportées du stockage congelé au dispositif de décongélation à l'intérieur du BioLife ThawSTAR® CFT Transporter alors qu'elles sont congelées sur de la glace sèche. Alternativement, les cryovials contenant des cellules peuvent être transférés congelés à <-150℃ à l'intérieur du BioT™ LN2 Transporter, qui contient en toute sécurité de l'azote liquide à l'intérieur d'un tampon absorbant/baffle.
  4. Placez le flacon dans une hotte à flux laminaire.
  5. Essuyer l'extérieur du flacon avec de l'éthanol à 70 % ou de l'isopropanol.
  6. Transférer dans les cellules décongelées la quantité souhaitée de milieu de croissance complet préchauffé adapté à votre lignée cellulaire. Les cellules décongelées et congelées dans des cryovials sont généralement pipetées hors du petit cryovial dans un tube à centrifuger contenant un milieu de croissance préchauffé.
  7. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant environ 5 à 10 minutes à température ambiante. La vitesse et la durée de la centrifugation varient en fonction du type de cellules.
  8. Une fois la centrifugation terminée, vérifiez la clarté du surnageant ainsi que la visibilité d'un culot complet.
  9. Sans perturber la pastille, verser progressivement le surnageant.
  10. Retirer le surnageant à l'aide d'une pipette et laisser une petite quantité de milieu pour s'assurer que le culot cellulaire n'est pas perturbé.
  11. Tapoter délicatement le tube pour remettre en suspension le culot cellulaire.
  12. Il faut les placer dans le récipient de culture cellulaire approprié ainsi que dans l'environnement de culture cellulaire suggéré.
  13. Les cellules sont maintenant prêtes à être utilisées dans des applications en aval.