Requisitos para células de congelação e descongelação

As linhas celulares estabelecidas são um recurso valioso para os laboratórios de investigação. No entanto, mesmo as linhas celulares mais bem conservadas numa cultura contínua podem ser susceptíveis à deriva genética, à senescência e à contaminação microbiana. Por conseguinte, as células devem ser congeladas e preservadas para armazenamento a longo prazo.

Seguem-se algumas diretrizes que são essenciais para a congelação de células. Tal como acontece com todos os procedimentos de cultura de células, é melhor seguir as instruções fornecidas com a sua linha de células para obter resultados óptimos.

  • Certifique-se de que as células estão pelo menos 90% viáveis e numa concentração elevada antes da congelação. Certifique-se de que segue as instruções de congelação ideais com base na linha celular que está a ser utilizada.
  • Utilizar um crio-congelador de velocidade controlada para congelar as células lentamente, reduzindo a temperatura a 1 grau por minuto.
  • Utilizar sempre o meio de congelação recomendado, como DMSO ou glicerol. Se estiver a congelar células primárias ou linhas celulares pela primeira vez, recomenda-se a utilização de um meio de congelação optimizado e específico para cada célula, como a família de meios de congelação BioLife CryoStor®.
  • Todas as soluções e equipamentos que entram em contacto com as células devem ser esterilizados, incluindo os frascos criogénicos utilizados para armazenar células congeladas.

O descongelamento de células congeladas pode ser um procedimento complicado, no qual é essencial ser rápido e preciso para garantir a sobrevivência da maioria das células. Para obter o melhor resultado possível, recomenda-se que siga rigorosamente as instruções fornecidas com as células e outros componentes. Para obter os melhores resultados, siga estas diretrizes:

  • Descongelar rapidamente as células num banho de água a 37° C até que todo o gelo visível tenha derretido
  • Antes de incubar as células, dilua-as utilizando um meio de crescimento pré-aquecido
  • Para melhorar a recuperação, coloque em placas as células que foram descongeladas a alta densidade
  • Trabalhar num exaustor de fluxo laminar e utilizar sempre a técnica asséptica correta
  • Utilizar equipamento de proteção pessoal, como uma máscara facial ou óculos de proteção (os frascos criogénicos que são mantidos em fase líquida podem explodir quando são descongelados)
  • Alguns meios de congelação contêm DMSO, que auxilia o processo de entrada de moléculas orgânicas nos tecidos. Certifique-se de que utiliza equipamento para manusear os produtos químicos que contêm DMSO.
  • O BioLife Cell Thawing Media é eficaz para volumes maiores de sangue do cordão umbilical/placentário que é criopreservado em sacos de DMSO.

Materiais necessários para descongelar as células

Processo passo-a-passo para descongelar células congeladas

  1. Comece por retirar o criovial que contém as células congeladas do armazenamento de azoto líquido ou do congelador ultrafrio.
  2. Colocar o frasco de células num banho de água a 37° C e agitar suavemente, até ficar apenas uma pequena quantidade de gelo. Em alternativa, utilize um instrumento automático de descongelação de células, como o BioLife ThawSTAR® CFT1.5 ou CFT2, inserindo o frasco criogénico congelado no dispositivo. Recupere-o quando o frasco for levantado no final do ciclo de descongelação e prossiga.
  3. Tenha em atenção que é importante diminuir a exposição à temperatura ambiente quando retirar as células congeladas do armazenamento. Se as células não forem utilizadas imediatamente, coloque-as em gelo seco ou num recipiente de azoto líquido. As células em frascos criogénicos de 1,8 ml e 2,0 ml podem ser transportadas do armazenamento congelado para o dispositivo de descongelação no interior do BioLife ThawSTAR® CFT Transporter enquanto estão congeladas em gelo seco. Em alternativa, os frascos criogénicos que contêm células podem ser transferidos congelados a <-150℃ dentro do BioT™ LN2 Transporter, que contém azoto líquido de forma segura dentro de uma almofada absorvente/baffle.
  4. Mova o frasco para um exaustor de fluxo laminar.
  5. Limpar o exterior do frasco com etanol a 70% ou isopropanol.
  6. Transferir para as células descongeladas a quantidade preferida de meio de crescimento completo pré-aquecido adequado à sua linha celular. As células descongeladas e congeladas em frascos criogénicos são geralmente pipetadas do pequeno frasco criogénico para um tubo de centrifugação contendo um meio de crescimento pré-aquecido.
  7. Centrifugar a suspensão de células a 200 x g durante cerca de 5-10 minutos à temperatura ambiente. A velocidade e a duração da centrifugação variam consoante os tipos de células.
  8. Quando a centrifugação estiver concluída, verifique a clareza do sobrenadante, bem como a visibilidade de um pellet completo.
  9. Sem perturbar o granulado, verter gradualmente o sobrenadante.
  10. Remover o sobrenadante com uma pipeta e deixar uma pequena quantidade de meio para garantir que o pellet de células não é perturbado.
  11. Bater cuidadosamente no tubo para ressuspender o pellet de células.
  12. Mova-os para o seu recipiente de cultura de células adequado, bem como para o ambiente de cultura de células sugerido.
  13. Agora as células estão prontas para serem utilizadas em aplicações a jusante.